乙型肝炎病毒（HBV），簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae），可導致肝硬化和肝癌的發(fā)生，給全球帶來(lái)嚴重的疾病負擔。據世界衛生組織（WHO）報道，全球有20多億人曾受到過(guò)乙型肝炎病毒（HBV）感染，大約3.5億至4億人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亞洲和非洲發(fā)病率尤其高。我國的乙肝病毒感染率約60%-70%；乙肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18%，以此計算，全國約有9300萬(wàn)人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)例。

　　盡管現有的抗病毒藥物可以控制乙型肝炎病毒，但卻不能完全清除它。因此，一旦停止治療患者肝臟中的HBV會(huì )重新活化。這是因為cccDNA“匿藏”在細胞核中。

　　細胞外的乙型肝炎病毒DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxedcircularDNA，rcDNA）分子。HBV的基因組（rcDNA）進(jìn)入到細胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主細胞因子的幫助下修復成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復制的原始模板。

　　只要還存在于肝細胞中，乙肝病毒cccDNA的復制就不會(huì )停止，并與病毒蛋白裝配成新的完整HBV病毒顆粒，以芽生的方式再感染健康的肝細胞，而這是導致乙肝復發(fā)的根本原因。因此，盡管每個(gè)肝細胞內只有約5～50個(gè)cccDNA拷貝，但是只要這些cccDNA池穩定，就可以使得病毒的持續感染延續，因而清除肝細胞內的cccDNA是乙肝徹底治愈所必需的。

　　CRISPR/Cas9系統靶向結合特異性的DNA序列，誘導靶DNA雙鏈發(fā)生精確切割。在哺乳動(dòng)物細胞中，這樣的切割能夠被一種被稱(chēng)作非同源末端連接（non-homologousend-joining，NHEJ）的緊急修復系統快速地修復。NHEJ是高效的，但是并不很準確，因而經(jīng)常導致一些DNA堿基在修復位點(diǎn)上插入或剔除。鑒于每次讀取DNA時(shí)是按密碼子（每個(gè)密碼子由連續的三個(gè)堿基組成）讀取的，在關(guān)鍵位點(diǎn)上發(fā)生的這些小的DNA序列變化經(jīng)常破壞相應的基因和它的蛋白產(chǎn)物的功能。基于，世界各地的研究人員嘗試利用CRISPR/Cas9系統治療HBV感染，并且取得重大進(jìn)展。

　　1.SciRep：利用CRISPR/Cas9系統高效地抑制HBV

　　ScientificReports，02June2015，doi：10.1038/srep10833

　　在一項新研究中，麻省理工學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9系統，對受到HBV感染的哺乳動(dòng)物肝細胞進(jìn)行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒（HBV）DNA。他們靶向切割了HBV病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）中的一些特異性位點(diǎn)。

　　在這項研究中，VyasRamanan和同事們設計了24條單向導RNA（sgRNA）來(lái)靶向從在線(xiàn)病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)初篩測試后，研究小組將三種最有效的sgRNA和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉導進(jìn)將HBVDNA整合到宿主基因組的人類(lèi)肝細胞內。

　　通過(guò)利用包含整合性HBV基因組DNA的穩定轉染細胞系展開(kāi)實(shí)驗，研究人員觀(guān)察到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時(shí)cccDNA下降了92%。他們還觀(guān)察到HBV病毒基因表達和復制水平顯著(zhù)減少。

　　如今，Ramanan計劃在人類(lèi)肝臟嵌合小鼠模型中測試這一方法，以評估和優(yōu)化傳遞方法和給藥方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到達人類(lèi)功能性的治愈。

　　2.MolTherNucleicAcids：利用CRISPR/Cas9抑制HBV感染

　　MolecularTherapyNucleicAcids，2014December；3（12）：e216，doi：10.1038/mtna.2014.68

　　在一項新的研究中，為了研究源自傳染性HBV的cccDNA是否能夠被直接靶向摧毀，來(lái)自美國福克斯蔡斯癌癥中心（FoxChaseCancerCente）的研究人員在表達HBV受體---鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白（sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide，NTCP）---的人HepG2中使用CRISPR/Cas9基因編輯系統。他們測試了不同的HIV特異性的向導RNA（gRNA），并證實(shí)它們能夠高達8倍地抑制HBV感染。這種抑制是HBVcccDNA發(fā)生突變和缺失---類(lèi)似于Cas9切割染色體DNA和隨后基于NHEJ介導的DNA修復時(shí)觀(guān)察到的情形---所導致的。α干擾素（IFN-α）并不對CRISPR/Cas9系統的抗病毒活性產(chǎn)生可衡量的影響，這提示著(zhù)Cas9和NHEJ活性并不受這種細胞因子（即IFN-α）誘導的先天免疫反應的影響。

　　3.MolTher：利用CRISPR/Cas9讓HBVcccDNA功能性滅活

　　MolecularTherapy，onlinepublication21June2016；doi：10.1038/mt.2016.94

　　在一項新的研究中，通過(guò)采用下一代測序（NGS）技術(shù)，來(lái)自美國福克斯蔡斯癌癥中心（FoxChaseCancerCente）的ChristophSeeger、JiASohn和同事們確定了在Cas9切割和基于非同源末端連接（NHEJ）的修復后，HBVcccDNA所發(fā)生的完整突變譜。他們發(fā)現，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割。此外，研究結果還表明，在Cas9切割后對HBVDNA進(jìn)行基因編輯的效率是在對被HBV感染的細胞進(jìn)行α干擾素（IFN-α）處理后發(fā)生的APOBEC蛋白介導的胞嘧啶脫氨基作用的1500倍以上。研究還發(fā)現，以前用來(lái)檢測DNA胞嘧啶脫氨基作用的3D-PCR方法方法高估了發(fā)生基因編輯的HBVDNA的數量和頻率。

　　總之，研究人員證實(shí)CRISPR/Cas9系統是迄今為止在功能上讓HBVcccDNA失活和提供一種慢性乙肝治愈療法的最好途徑。

　　4.GeneTher：我國科學(xué)家利用CRISPR破壞乙肝病毒

　　GeneTherapy，2015，22，404–412；doi：10.1038/gt.2015.2；publishedonline5February2015

　　2015年2月5日，來(lái)自我國軍事醫學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫學(xué)院研究所、第四軍醫大學(xué)西京醫院、日本京都大學(xué)和華中農業(yè)大學(xué)獸醫學(xué)院等處的研究人員，在Nature旗下GeneTherapy期刊上發(fā)表一項最新的研究成果，題為“Harnessingtheclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat（CRISPR）/CRISPR-associatedCas9systemtodisruptthehepatitisBvirus”。在這項研究中，研究人員研究靶向乙肝表面抗原（HBsAg）編碼區的CRISPR/Cas9系統，在體外培養的肝細胞中和活的小鼠體內的效果。結果表明，CRISPR/Cas9可在體內和體外抑制HBV復制和表達，可能是治療HBV感染的一種新策略。

　　5.MolTherNucleicAcids：利用CRISPR/Cas9系統在體內促進(jìn)肝內HBV模板清除

　　MolecularTherapyNucleicAcids，2014，3，e186；doi：10.1038/mtna.2014.38

　　在當前的抗病毒治療下，HBVcccDNA持續存在是根治慢性乙肝的一大障礙。治愈慢性乙肝需要新的策略來(lái)特異性地破壞HBVcccDNA。為了研究CRISPR/Cas9系統是否能夠切割HBV基因組，來(lái)自中國國立臺灣大學(xué)的研究人員設計出8種針對A基因型HBV的gRNA。利用這些HBV特異性的gRNA，CRISPR/Cas9系統顯著(zhù)性地降低感染上HBV表達載體的Huh7細胞中的乙肝核心抗原（HBcAg）和乙肝表面抗原（HBsAg）產(chǎn)生。在這8種篩選出的gRNA中，他們鑒定出兩種有效的gRNA。有趣的是，其中的一種靶向保守性HBV序列的gRNA在不同基因型的HBV中都能發(fā)揮作用。

　　利用一種流體動(dòng)力學(xué)-HBV持續存在小鼠模型，研究人員進(jìn)一步證實(shí)這種CRISPR/Cas9系統能夠切割肝內含有HBV基因組的質(zhì)粒，促進(jìn)它在體內被清除，從而導致血液中的HBsAg水平下降。

　　這些數據提示著(zhù)CRISPR/Cas9系統能夠在體外和體內破壞HBV表達模板，并且表明它有潛力根除持續性HBV感染。

　　6.VirusRes：利用CRISPR/Cas9系統在體內和體外誘導抗HBV效應

　　VirusResearch，Volume217，2June2016，Pages125–132，doi：10.1016/j.virusres.2016.04.003

　　在一項新的研究中，來(lái)自中國同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9系統靶向剔除HBV基因組中的保守性區域。通過(guò)讓核酸內切酶Cas9攜帶HBVS基因和X基因的同源序列，他們構建出pCas9。通過(guò)利用pCas9開(kāi)展實(shí)驗，他們證實(shí)pCas9-2能夠更好抵抗HBV產(chǎn)生，而且在Huh7和HepG2細胞之間沒(méi)有顯著(zhù)差異。

　　在M-TgHBV的HBV感染小鼠模型中，注射pCas9會(huì )降低血液中的HBsAg水平和肝臟中的HBcAg水平。

　　總之，這種人工構建的CRISPR/Cas9系統能夠誘導抗HBV效應，而且有潛力作為一種新的療法治療慢性HBV感染。

　　7.SciRep：利用CRISPR/Cas9系統破壞HBVS基因和X基因保守性序列

　　ScientificReports，2015Sep3；5：13734.doi：10.1038/srep13734

　　為了在治療上應用于人體，人工設計出的核酸內切酶Cas9應當能夠識別不同基因型的HBV，同時(shí)產(chǎn)生最小的脫靶效應。

　　針對此，在一項新的研究中，德國研究人員鑒定出HBV基因組的S區域和X區域在不同基因型中都保守的HBV序列，而且能夠利用一種Cas9酶特異性地和高效地靶向切割這些保守性序列。這一方法不僅破壞報告細胞系中的游離HBVcccDNA和HBV在染色體上的整合靶位點(diǎn)，而且也破壞慢性感染和新感染的肝癌細胞系中的HBV復制。

　　這些數據提示著(zhù)將CRISPR/Cas9系統作為旨在治愈HBV感染的新策略具有可行性。

　　8.WorldJGastroenterol：利用雙gRNA指導的CRISPR/Cas9系統高效地抑制HBV復制

　　WorldJournalofGastroenterology，2015Aug28；21（32）：9554-65，doi：10.3748/wjg.v21.i32.9554

　　為了篩選和研究有效地抵抗A、B、C和D基因型HBV的gRNA，來(lái)自中國北京大學(xué)醫學(xué)部的研究人員總共設計出15種gRNA（分別記為gRNA-1，gRNA-2，…，gRNA-15）。他們從中選擇了11種靶向HBV基因組調節區域的雙gRNA組合。他們研究了每種gRNA和這11種雙RNA組合抑制A、B、C和D基因型HBV復制的效率。

　　研究人員證實(shí)所有的gRNA能夠顯著(zhù)地抑制體外細胞培養物中的HBsAg或HBeAg產(chǎn)生，所有雙RNA組合能夠高效地抑制A、B、C和D基因型HBV中的HBsAg或HBeAg產(chǎn)生，而且當與單個(gè)gRNA相比時(shí)，雙RNA組合抑制HBsAg或HBeAg產(chǎn)生的效率顯著(zhù)增加。

　　再者，通過(guò)利用PCR直接測序，研究人員證實(shí)這些雙gRNA組合能夠通過(guò)移除這兩種使用的gRNA的切割位點(diǎn)之間的序列片段，特異性地破壞HBV表達模板。最為重要的是，gRNA-5和gRNA-12的雙gRNA組合不僅能夠高效地抑制HBsAg和/或HBeAg產(chǎn)生，而且也破壞HepAD38細胞中的HBVcccDNA池。

　　這些結果提示著(zhù)CRISPR/Cas9系統能夠高效地破壞HBV表達模板（A、B、C和D基因型HBV），而且沒(méi)有明顯的細胞毒性。

　　9.JGenVirol：利用CRISPR/Cas9系統抑制不同基因型HBV復制

　　JournalofGeneralVirology，2015Aug；96（8）：2252-61，doi：10.1099/vir.0.000159

　　為了研究利用CRISPR/Cas9系統是否可能破壞HBVDNA模板，來(lái)自中國武漢大學(xué)的研究人員設計出8種靶向不同基因型HBV的保守區域的gRNA，而且這些gRNA能夠在體外和體內顯著(zhù)地抑制HBV復制。再者，這種HBV特異性的gRNA/Cas9系統能夠抑制不同基因型HBV在細胞中的復制，而且利用單個(gè)gRNA/Cas9系統能夠顯著(zhù)降低HBVDNA，而且利用不同的gRNA/Cas9系統組合能夠清除HBVDNA。

　　10.AntiviralRes：利用CRISPR/Cas9系統高效抑制HBV復制

　　AntiviralResearch，Volume118，June2015，Pages110–117，doi：10.1016/j.antiviral.2015.03.015

　　作為一種新的基因組編輯工具，CRISPR/Cas9系統能夠被用來(lái)準確地和高效地改造和修飾基因組DNA。

　　在一項新的研究中，來(lái)自中國蘇州大學(xué)的研究人員合成出4種靶向HBV基因組保守區域的單向導RNA（sgRNA）。在Huh7細胞和HBV復制性細胞HepG2.2.15中，CRISPR/Cas9系統降低HBV產(chǎn)生。他們進(jìn)一步證實(shí)CRISPR/Cas9的直接切割和這種切割介導的突變發(fā)生于轉染細胞的HBVcccDNA中。

　　在攜帶HBVcccDNA的小鼠模型中，通過(guò)快速地尾靜脈注射含sgRNA-Cas9的質(zhì)粒導致較低水平的HBVcccDNA和HBV蛋白產(chǎn)生。

　　總之，這種CRISPR/Cas9系統能夠準確地和高效地靶向HBVcccDNA和抑制HBV復制。它有可能被用來(lái)治療慢性HBV感染。

　　11.Virology：利用CRISPR/Cas9系統抑制HBVDNA積累

　　Virology，Volume476，February2015，Pages196–205，doi：10.1016/j.virol.2014.12.001

　　在一項新的研究中，來(lái)自美國杜克大學(xué)和埃默里大學(xué)的研究人員通過(guò)對細菌Cas9基因和單向導RNA（sgRNA）進(jìn)行慢病毒轉導，觀(guān)察到在體外的HBV慢性感染和新感染的模型中，HBVDNA產(chǎn)生受到高效抑制。HBV特異性的Cas9/sgRNA組合降低總HBVDNA水平高達1000倍左右和降低HBVcccDNA水平高達10倍左右，而且也通過(guò)突變讓殘留的絕大多數HBVDNA失活。

　　總之，這些數據提供概念驗證表明CRISPR/Cas9系統有潛力有效地剔除慢性HBV感染者體內的HBVcccDNA池。