基于實(shí)時(shí)熒光逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法的病毒核酸檢測是目前新冠病毒感染確診的重要手段。然而，一直有媒體及專(zhuān)家反映，新冠病毒核酸檢測的陽(yáng)性率低，有的病例重復檢測多次陰性后又出現陽(yáng)性結果，咽拭子標本多次檢測陰性、但最后在呼吸道灌洗液標本中檢測出陽(yáng)性結果等問(wèn)題。

為明確這些問(wèn)題的原因，近日，解放軍總醫院第一醫學(xué)中心醫學(xué)檢驗中心王成彬主任在《中華醫學(xué)雜志》在線(xiàn)發(fā)表文章《核酸檢測用于確診新型冠狀病毒肺炎陽(yáng)性率低的原因分析》，從患者病程、標本采集、標本運輸與保存、標本處理、核酸提取與擴增、病毒核酸變異等方面對影響核酸檢測結果準確性的原因進(jìn)行分析。

目前，無(wú)論是臨床實(shí)驗室還是疾病預防控制中心（CDC）實(shí)驗室，普遍應用的是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行病毒核酸檢測。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，該方法是將標本中的特定核酸序列進(jìn)行擴增，理論上每一次擴增后的核酸數量都是成倍增加，經(jīng)過(guò)40次以上擴增后，其核酸數量可達到足夠通過(guò)熒光等常規方法進(jìn)行檢測。

我們應在重視和肯定核酸檢測在病毒感染診斷中重要價(jià)值的同時(shí)，也要客觀(guān)考慮由于其方法學(xué)特點(diǎn)、疾病發(fā)展過(guò)程、標本采集、標本保存與運輸、核酸提取、擴增體系、人員操作等多方面因素都可能造成最后檢測結果的假陰性或假陽(yáng)性。那么，上述因素具體如何影響最終檢測結果呢？

病毒存在量是否“達線(xiàn)”

大部分新冠肺炎患者的發(fā)病都會(huì )經(jīng)歷一個(gè)從感染后無(wú)癥狀到輕度癥狀出現，直至痊愈；少部分患者會(huì )發(fā)展到嚴重癥狀出現的過(guò)程。

不同病程、不同病情患者的機體中病毒存在量可能不同，導致已有病毒感染，但由于在相關(guān)部位采集不到病毒或采集到的病毒量太少，以至于用現有方法檢測不到。

因此，對臨床高度疑似新冠肺炎患者，應該連續采集標本進(jìn)行核酸檢測（這可能是臨床患者多次檢測陰性，陽(yáng)性結果出現晚的主要原因之一）。其實(shí)，任何病原學(xué)檢測都不能只根據1次陰性結果而做出排除性診斷，更不能根據核酸檢測陰性而漏診臨床高度疑似的新冠肺炎患者，尤其在高發(fā)地區和大面積流行期間。

標本采集運輸是否規范

1.標本采集部位很多專(zhuān)家從實(shí)踐工作中總結出的經(jīng)驗認為，鼻咽拭子標本核酸檢測陽(yáng)性率高于口咽拭子，下呼吸道采集的痰、肺泡灌洗液標本陽(yáng)性率高于上呼吸道的口、鼻咽拭子采集的標本（這也是近期被廣泛評論的某患者咽拭子標本3次核酸檢測陰性，收住院后在搶救過(guò)程中采集肺泡灌洗液標本核酸檢測陽(yáng)性的原因）。但是，下呼吸道的痰、肺泡灌洗液標本采集難度太大、易引起患者噴濺導致采集操者感染風(fēng)險增大。因此，一般情況下，不建議使用（氣管切開(kāi)、呼吸機搶救患者可用）。

《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版修正版）》已將標本采集“咽拭子”更新為“鼻咽拭子”。為提高檢測陽(yáng)性率，建議采集同一患者多部位標本，合并進(jìn)行檢測。例如，用口咽拭子、鼻咽拭子同時(shí)采集標本，然后放到同一采集管中送檢。對于有消化道癥狀的疑似患者，可同時(shí)采集糞便或肛拭子進(jìn)行檢測。

2.標本采集方法采樣的準確性存在操作者個(gè)人的依賴(lài)性。如果標本采集者操作不規范，也會(huì )導致采樣誤差。如果平時(shí)醫護人員咽拭子取樣不多，刮取標本時(shí)患者的反應又比較大，往往導致刮取標本的位置不對，或力度和時(shí)間不夠，沒(méi)有刮取到帶病毒的標本或刮取到的帶病毒標本量少，最后檢測結果陰性率必然增加。

3.標本運輸及保存新冠病毒很容易被來(lái)自試劑、耗材等外源性或細胞破壞后所釋放的內源性RNA酶降解，而影響最后的檢測效率。

嚴格來(lái)講，標本采集后應及時(shí)送到實(shí)驗室（疾控中心、醫院檢驗科、第三方實(shí)驗室），盡快完成檢測。

標本在常溫下放置時(shí)間過(guò)長(cháng)也可能造成最后檢測結果假陰性。

雖然，我們可以使用防病毒核酸降解的標本采集管，但目前此類(lèi)產(chǎn)品數量少、成本高、實(shí)際應用效果尚需要進(jìn)一步評價(jià)。因此，我們建議標本采集后應及時(shí)送檢，及時(shí)檢測（4小時(shí)）。

檢測環(huán)節是否標準化

1.核酸提取方式前面已述及新冠病毒的核酸檢測需要對所采集標本的核酸進(jìn)行提取。

目前，實(shí)驗室較常用的提取標本核酸的方法為手工提取和核酸全自動(dòng)提取儀提取。

手工法實(shí)驗過(guò)程由于人員等因素難以做到標準化；全自動(dòng)核酸提取儀法在整個(gè)過(guò)程中需使用配套的核酸提取儀及相應的試劑，整個(gè)操作易于標準化。

相比于手工法，核酸全自動(dòng)提取儀可避免一些手工操作容易出現的差錯，對于檢測結果影響較小。

而不同提取試劑和手工提取流程的掌控對最后提取到的核酸數量和質(zhì)量可能存在差別。與此同時(shí)，從標本中所提取出的核酸數量和質(zhì)量對于檢測方法中下一個(gè)步驟的核酸擴增至關(guān)重要，從而直接影響最后的檢測結果。

2.核酸擴增環(huán)節由于不同廠(chǎng)家的試劑研發(fā)是根據新冠病毒核酸OFR1ab、N、E等基因的特異性序列設計的擴增探針（不同廠(chǎng)家的擴增試劑可分為1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)靶標基因位點(diǎn)檢測試劑），而包含有不同靶標基因位點(diǎn)的試劑檢測敏感度、特異度不同，試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量的差異等，也都可能影響擴增效率和最后的檢測結果。

3.試劑研發(fā)與應用由于導致本次疫情的是一種新型病毒，加之疫情的突發(fā)性，試劑生產(chǎn)商只能根據有限公開(kāi)的病毒核酸研究數據來(lái)開(kāi)展試劑研發(fā)。

國家相關(guān)部門(mén)最早推薦了一些廠(chǎng)家的檢測產(chǎn)品，后來(lái)又審批了多個(gè)廠(chǎng)家檢測試劑的注冊申請。試劑生產(chǎn)廠(chǎng)家不同，核酸檢測試劑盒的質(zhì)量參差不齊，也會(huì )影響檢測結果。

目前，開(kāi)展新冠病毒檢測試劑研發(fā)生產(chǎn)的廠(chǎng)家已超過(guò)百家。正常情況下，一個(gè)臨床檢測試劑產(chǎn)品從研發(fā)到應用需要通過(guò)一系列的臨床驗證與評估，但由于本次疫情的特殊性，時(shí)間緊迫，因此，研發(fā)試劑來(lái)不及完成常規流程，特別是無(wú)法得到一定數量的臨床患者標本的驗證。

有些廠(chǎng)家只能用新冠病毒目標RNA序列通過(guò)噬菌體蛋白外殼包裹等方式模擬真實(shí)標本中的病毒進(jìn)行驗證。因此，對于臨床某些高度疑似病例，或檢測結果難以確定病例，建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測、驗證。

近期，中華醫學(xué)會(huì )檢驗醫學(xué)分會(huì )組織了相關(guān)方面專(zhuān)家對新冠病毒核酸檢測工作進(jìn)行了探討，并出臺了核酸檢測相關(guān)專(zhuān)家共識，同時(shí)一些新的基因檢測平臺也在不斷研發(fā)。隨著(zhù)基因測序、數字PCR、RTPCR毛細管電泳等技術(shù)的應用，新冠病毒核酸檢測中的問(wèn)題一定會(huì )得到持續改進(jìn)。