一、化合物pKa的估算與初步測定

　　一、pKa

　　酸性物質(zhì)的pKa是酸解離常數的負對數，堿性物質(zhì)的pKa是其共軛酸解離常數的負對數。

　　了解酸或堿性物質(zhì)的pKa值，可以方便的計算出藥物在不同pH溶液中分子型（未解離型）和離子型(解離型)組分比例，對于我們建立和優(yōu)化色譜條件具有重要意義。

　　容易得到，對于酸性物質(zhì)：

　　對于堿性物質(zhì)：

　　根據我們以前的推論：

　　K’、KI’、Kf’分別為總容量因子、離子型容量因子和分子型容量因子。

　　由此可見(jiàn)，分子型和離子型的比例，直接決定了化合物的保留，尤其是在KI’和Kf’相差較大的時(shí)候。

　　二、pKa估算

　　一般藥物的pKa都可以從文獻上獲得，對于不能從文獻獲得的，可以進(jìn)行初步估算。

　　(1)酸pKa估算

　　酸性藥物一般以含羧基的居多。

　　當羧基與烷基連接時(shí)pKa一般在在4~5之間，如甲酸、乙酸和丙酸的pKa分別為3.8、4.7和4.8。

　　當含有吸電子基團，酸性增強，pKa相應降低，可參考氯乙酸（pKa2.9），羥基乙酸（pKa3.8)粗布估算。

　　當羧基與芳環(huán)連接時(shí)，pKa一般在3~6之間，可以苯甲酸（pKa4.2）為基準，根據苯環(huán)上取代的位置和取代基團進(jìn)行估算。如水楊酸（鄰羥基苯甲酸）pKa=3.0。

　　(2)堿pKa估算

　　堿性藥物一般為脂肪胺、芳胺和含N雜環(huán)類(lèi)化合物，對于羧酸鹽類(lèi)，可以運用其相應羧酸的pKa進(jìn)行計算。

　　脂肪胺：pKa一般在9~11之間，如甲胺、乙胺、三乙胺pKa分別為10.6、10.8、11.1。

　　當含有吸電子基團，堿性降低，pKa相應降低，可以三乙醇胺（pKa=7.8）、乙二胺（pKa1=9.9）為參考。

　　芳胺：可以苯胺（pKa4.6）為基準，根據苯環(huán)上取代的位置和取代基團進(jìn)行估算。如水楊酸（鄰羥基苯甲酸）pKa=3.0。

　　N雜環(huán)：可以母核為基準，根據取代基團的性質(zhì)和未知估算：

　　脂肪胺類(lèi)堿性較強，要完全抑制它們的質(zhì)子化，pH需要達到11~13以上，普通色譜柱難以承受如此高的pH，需要使用耐高pH值色譜柱。在普通色譜柱承受的pH范圍內，它們幾乎都以離子型（完全質(zhì)子化）存在。

　　芳胺pKa在普通色譜柱承受的pH范圍內，調節流動(dòng)相pH即可調節保留。

　　N雜環(huán)化合物中，吡嗪、吡咯、吲哚、噁唑、異噁唑堿性極弱，幾乎不解離，流動(dòng)相可以不加緩沖鹽；其它pKa也多在普通色譜柱承受的pH范圍內，調節流動(dòng)相pH即可調節保留。

　　三、pKa和初步測定

　　文獻上有多種測定化合物pKa的方法，本文介紹一種HPLC測定pKa的方法。以酸性物質(zhì)為例，介紹測定方法的原理。

　　根據式（1）我們知道，在流動(dòng)相pH遠小于pKa（差值不低于2）時(shí)，酸性物質(zhì)99%以上以分子型存在，此時(shí)測得的容量因子即可作為分子型的容量因子(kf’)。同理，可以在流動(dòng)相pH遠大于pKa（差值不低于2）時(shí)測定出離子型的容量因子（kI’)。

　　在流動(dòng)相選擇中間pH條件下，測定化合物k’。由于kI’、kf’已經(jīng)測出，根據式（3）即可以計算出xI和xf，將它們和流動(dòng)相的pH代入式（1）就可以計算出化合物pKa。

　　以下為苯甲酸pKa的測定示例：

　　色譜條件：

　　色譜柱：SB-C18(4.6*150mm,5um）

　　流速：1.0ml/min

　　測試波長(cháng)：240nm

　　柱溫：30℃

　　進(jìn)樣體積：10uL

　　供試品溶液：0.1mg/ml（流動(dòng)相溶解）

　　流動(dòng)相：緩沖液-ACN（80：20）

　　測定結果如下：

　　pH2.1時(shí)可以認為苯甲酸解離被抑制，此時(shí)的k’可以作為分子型的kf’，pH7.2時(shí)可以認為苯甲酸完全解離，此時(shí)的k’可以作為離子型的kI’，即可以認為kf’=6.88，kI’=0。

　　pH4.4時(shí)，k’=xIkI’+xfkf’=3.77，由此計算xf=0.55，xI=1-xf=0.45，分子型與離子子型比值為1.22。

　　根據式（1）即算出pKa=4.5，該值與文獻值4.2基本吻合。

　　二、一個(gè)峰還是兩個(gè)峰？離子型和分子型的相伴相生

　　對于在流動(dòng)相中易離解的化合物（比如酸和堿），離子型和分子型的極性通常相差很大，那么他們在HPLC中是否會(huì )被分離為離子型和分子型的兩個(gè)色譜峰呢？

　　事實(shí)上，這個(gè)問(wèn)題可以用酸堿平衡理論解釋。下面以酸性物質(zhì)（HS）為例，看看它們在色譜柱中的色譜行為：

　　HS在流動(dòng)相中存在下列離解平衡：

　　HS→H++S-

　　如果HS解離常數為Ka，則有：

　　Ka=[H+][S-]/[HS]

　　即：[S-]/[HS]=Ka/[H+]

　　如果保持流動(dòng)相中[H+]恒定（使用緩沖溶液），[S-]/[HS]也將恒定。這說(shuō)明在譜帶上任何一點(diǎn)，離子型和分子型比例都是恒定的。也就是說(shuō)分子型和離子型相伴以恒定的比例流出色譜柱，出現的色譜峰是分子型和離子型的疊加。分子型的峰型和離子型的峰形始終保持一致，相伴相生。

　　上述結論是建立在以下兩個(gè)前提之上的：

　　(1)離解平衡迅速達到。

　　(2)流動(dòng)相中[H+]恒定；

　　通常酸堿解離都能達到快速平衡。通常情況下，使用合適緩沖鹽即可使流動(dòng)相中[H+]恒定。但如果緩沖容量超載（組分酸堿性過(guò)強、進(jìn)樣量過(guò)大、緩沖鹽選擇不合適、緩沖液濃度過(guò)低），由于譜帶上各點(diǎn)被分離組分濃度存在差異，無(wú)法保證每一點(diǎn)離子型和分子型比例都保持恒定，導致出現峰變形甚至分裂。

　　對于堿性物質(zhì)，同理也可得到上述結論。事實(shí)上，對于流動(dòng)相中存在二次平衡的物質(zhì)的分離，都可按同樣思路進(jìn)行分析。比較典型的離子是糖的色譜分析，糖分離過(guò)程中存在α型和β型互變：

　　α型→β型

　　只要平衡足夠快，我們就會(huì )得到一個(gè)尖銳和幾乎對稱(chēng)的色譜峰，但事實(shí)上該互變平衡較為緩慢，導致色譜峰型變寬甚至分裂。因此糖分離中通常使用氨基柱和采用高柱溫，希望快速達到互變平衡（堿性條件和高溫能加速達到平衡）。

　　類(lèi)似的例子還有乙酰乙酸乙酯在流動(dòng)相中的二次平衡（酮式和烯醇式互變），甚至離子對色譜法也存在諸多二次平衡。

　　三、易離解化合物的保留

　　我們知道，離子型組分極性大，容量因子小，保留低，分子型組分極性小，容量因子大，保留大。那么，對于一個(gè)在流動(dòng)性中易解離的化合物（酸或堿），它的保留情況如何呢？

　　還是以酸性物質(zhì)（HS）為例，在色譜柱中同時(shí)存在離解平衡和分配平衡：

　　Kf、KI分別為分子型和離子型在固定相和流動(dòng)相中的分配系數：

　　按分配系數定義，組分（離解型和分子型之和）在固定相和流動(dòng)相中總分配系數K為：

　　將（1）（2）代入（3）得到：

　　XI、Xf分別為離子型和分子型占比，XI+Xf=1。

　　兩邊同時(shí)除以相比得到：

　　K’、KI’、Kf’分別為總容量因子、離子型容量因子和分子型容量因子。該式顯示，總容量因子為各狀態(tài)組分所占比例與該狀態(tài)容量因子乘積之和。顯然，通常情況下Kf’＞＞KI’，故分子型占比越多，總容量因子越大，保留越強。

　　根據解離常數可以得到：

　　顯然，流動(dòng)相pH比組分pKa小2時(shí)，分子型與離子型之比達到100，組分幾乎均以分子型存在，總容量因子貢獻幾乎全部來(lái)源于分子型，保留也最強。流動(dòng)相pH比組分pKa大2時(shí)，離子型與分子型之比達到100，組分幾乎均以離子型存在，總容量因子貢獻幾乎全部來(lái)源于離子型，保留也最弱。

　　（4）式和（6）式同時(shí)給我們優(yōu)化色譜條件帶來(lái)更多選擇，即可以?xún)H通過(guò)調節流動(dòng)相pH改變分子型和離子型比例來(lái)改變組分的保留值。

　　對于堿性物質(zhì)，我們也可以按上述方法得到相同結論。