細胞培養時(shí)如何減少乳酸積累？

2018-04-13 來(lái)源：藥渡標簽：掌上醫生喝茶減肥一天瘦一斤安全減肥 cps聯(lián)盟美容護膚

摘要：乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內，是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通過(guò)下調LDH-A的含量可以有效降低細胞培養過(guò)程中乳酸的積累，這點(diǎn)在眾多的文獻中均已得到證實(shí)。

CHO細胞是目前用于單抗的生產(chǎn)最廣泛的細胞株，用以培養CHO細胞的培養基含有豐富的營(yíng)養物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸、無(wú)機鹽、維生素等，部分營(yíng)養物質(zhì)會(huì )被轉化為細胞毒性的代謝廢物(乳酸、銨等)。銨的積累不僅會(huì )影響細胞的生長(cháng)和蛋白產(chǎn)量，還會(huì )改變蛋白的糖基化修飾；同樣，乳酸的產(chǎn)生會(huì )降低培養體系的pH，為調節pH而添加的堿液及高濃度的乳酸本身導致體系滲透壓的增加，進(jìn)而影響到細胞成長(cháng)和蛋白產(chǎn)量與質(zhì)量。筆者在此將促進(jìn)乳酸代謝的一些策略進(jìn)行了簡(jiǎn)單總結，可分為基因工程、添加物添加和培養策略改變。

LDH

乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內，是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通過(guò)下調LDH-A的含量可以有效降低細胞培養過(guò)程中乳酸的積累，這點(diǎn)在眾多的文獻中均已得到證實(shí)。SooMinNoh等在GS篩選體系中運用shRNA技術(shù)構建了低表達LDH的細胞株CHO-K1LDHsi、GSKOLDHsi，與對照細胞組CHO-K1、GSKO相比，其乳酸的累積明顯降低，如圖1所示。

在此研究中對其他代謝參數的改變也進(jìn)行了探討，如銨的積累，基因改造細胞株也較對照組要低些，這可能要歸功于GS篩選系統本身的優(yōu)勢。這種下調LDH表達量的技術(shù)不會(huì )影響到單抗的產(chǎn)量，Soo團隊在對單抗的質(zhì)量屬性分析中發(fā)現LDH下調對糖基化具有影響，但不會(huì )影響到聚體與電荷異質(zhì)性。但其并不推薦在GS系統中實(shí)行下調LDH的基因工程技術(shù)，因其會(huì )影響到GS系統的篩選能力。還有一點(diǎn)也是值得注意的，完全的LDH基因去除對CHO細胞是致命的。

圖1LDH下調細胞株CHO-K1LDHsi(白色圓形)、GSKOLDHsi(白色方形)，和其對照CHO-K1(黑色圓形)、GSKO(黑色方形)的乳酸累積比較(來(lái)源于參考文獻1)

PYC2

丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase，PYC2)重組表達是哺乳動(dòng)物細胞中常見(jiàn)的降低乳酸形成的策略，PYC2是糖異生循環(huán)中重要的限速酶，參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉化生成葡萄糖的催化，因此PYC2在CHO細胞中的高表達可以加速對乳酸的消耗。

Toussaint等在CHO細胞中成功構建了高表達PYC2的克隆，其團隊將帶有PYC2基因片段的質(zhì)料pTT18嘗試導入129株CHO克隆，從中選取了11株P(guān)YC2-positive克隆進(jìn)行后續的實(shí)驗。不論是檢測到的乳酸含量、體系的pH變化、又或是細胞VCD和VIA，實(shí)驗數據均表明PYC2-positive組均較對照組和PYC2-nagetive組消耗了更多的乳酸。同時(shí)將這11株P(guān)YC2-positive克隆在5種常用的商業(yè)培養基中進(jìn)行試驗，得到了相同的實(shí)驗結果，與對照相比其乳酸含量總是較低些。

Toussaint團隊還在批培養和補料分批培養中對PYC2-positive克隆(11號克隆)對乳酸降解的情況進(jìn)行了驗證，結果如圖2所示。11號克隆的peakVCD幾乎超過(guò)對照組的兩倍，后期乳酸也被消耗。值得關(guān)注的是當使用11號克隆進(jìn)行Fed-batch實(shí)驗時(shí)，乳酸開(kāi)始消耗時(shí)葡萄糖的含量還維持在40mM，即PYC2-positive克隆對乳酸的降解不受葡萄糖濃度的限制。

銅離子

培養基成分始終是細胞培養中重要的一環(huán)，其中微量元素銅離子曾在多種CHO細胞中被證實(shí)可以促進(jìn)細胞生長(cháng)及減少乳酸積累。SenXu等在ambr15微反應器中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗，其在基礎培養基中添加了不同濃度的硫酸銅(1×?200×)，并在D4和D6分別進(jìn)行了補糖操作。結果見(jiàn)圖3，通過(guò)比較D4和D6補糖后硫酸銅實(shí)驗組和對照組間細胞密度與乳酸含量的變化，可知銅離子的添加可促進(jìn)細胞對乳酸的消耗及細胞生長(cháng)。

究其生化層面的原因，銅離子是細胞色素c重要的輔因子，而細胞色素c參與線(xiàn)粒體膜上電子的傳遞過(guò)程，細胞色素c的多寡與銅離子直接相關(guān)。研究表明，線(xiàn)粒體氧化能力降低會(huì )造成高濃度的乳酸積累，而銅離子缺失會(huì )影響線(xiàn)粒體功能及代謝能力進(jìn)而擴大乳酸生成路徑。銅離子的加入可能擴大了線(xiàn)粒體的氧化容量，從而降低了乳酸的累積。另外，銅離子添加會(huì )影響到單抗的質(zhì)量，如增加堿性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。

葡萄糖

用其他代謝緩慢的糖類(lèi)代替葡萄糖的策略也是降解乳酸的途徑之一，其中半乳糖是研究較多的一種。用半乳糖、巖藻糖、甘露糖和麥芽糖作為第二碳源對乳酸積累的影響見(jiàn)圖4，除甘露糖外其他糖類(lèi)的添加均可降低乳酸的積累；當以半乳糖代替葡萄糖時(shí)細胞活率出現快速下降，這是因為細胞對半乳糖的降解速率緩慢，為避免這種情況可考慮將其他糖類(lèi)與半乳糖共同使用。

低糖消耗乳酸也是細胞培養時(shí)常見(jiàn)的策略。早期的一項研究表明，高濃度的葡萄糖會(huì )導致高濃度的乳酸積累，限制葡萄糖及谷氨酰胺濃度后乳酸的含量也得到限制，但對于兩者的最低濃度范圍還沒(méi)有定論。Yogender等研究了30mM和10mM的葡萄糖對細胞生長(cháng)和乳酸代謝的影響，其結果如圖5，雖然低濃度葡萄糖的細胞密度較高濃度葡萄糖低，但其乳酸含量也低些，證明低糖確實(shí)有利于乳酸降解。

同時(shí)，研究員還通過(guò)RNA-Seq技術(shù)對CHO細胞中的27629個(gè)基因進(jìn)行了分析，其中10090個(gè)基因在兩種不同濃度葡萄培養時(shí)表達，而只有575個(gè)基因表達量具有區別。更精確的分析表明，涉及糖酵解、TCA循環(huán)和糖基化的基因在兩種不同濃度葡萄糖時(shí)均沒(méi)有超過(guò)2倍的表達量區別，也就是說(shuō)控制低濃度的葡萄糖對單抗的糖基化影響不大。但有研究指出低濃度的葡萄糖會(huì )影響糖基化的位點(diǎn)，這可能也與細胞株有很大聯(lián)系。

看本篇文章的人在健客購買(mǎi)了以下產(chǎn)品更多>

用于腸道菌群失調引起的腸功能紊亂，如急、慢性腹瀉等。

健客價(jià)：￥23

皮膚外用藥。適用于治療手足皸裂癥和魚(yú)鱗病。

健客價(jià)：￥18

用于腸內異常發(fā)酵、消化不良、腸炎和小兒腹瀉。

健客價(jià)：￥5

適用于敏感菌引起的：泌尿生殖系統感染，包括單純性、復雜性尿路感染、細菌性前列腺炎、淋病奈瑟菌尿道炎或宮頸炎（包括產(chǎn)酶株所致者）。呼吸道感染，包括敏感革蘭陰性桿菌所致支氣管感染急性發(fā)作及肺部感染。

健客價(jià)：￥9.5

乳酸鈣顆粒用于預防和治療鈣缺乏癥，如骨質(zhì)疏松、手足抽搐癥、骨發(fā)育不全、佝僂病以及兒童、妊娠和哺乳期婦女、絕經(jīng)期婦女、老年人鈣的補充。

健客價(jià)：￥20

本品適用于敏感細菌引起的：泌尿生殖系統感染、呼吸道感染、胃腸道感染、傷寒、骨和關(guān)節感染、皮膚軟組織感染、敗血癥等。 (詳見(jiàn)包裝內部說(shuō)明書(shū))

健客價(jià)：￥27

用于小面積、輕度外傷創(chuàng )面及感染創(chuàng )面的消毒。

健客價(jià)：￥27

用于腸內異常發(fā)酵、消化不良、腸炎和小兒腹瀉。

健客價(jià)：￥12

用于腸內異常發(fā)酵、消化不良、腸炎和小兒腹瀉。

健客價(jià)：￥52

本品適用于敏感細菌所引起的下列輕、中度感染：呼吸系統感染：急性支氣管炎、慢性支氣管炎、慢性支氣管炎急性期發(fā)作、彌漫性細支氣管炎、支氣管擴張合并感染、肺炎、咽喉炎、扁桃體炎（扁桃體周?chē)撃[）；泌尿系統感染：腎盂腎炎、復雜性尿路感染等；生殖系統感染：前列腺炎、附睪炎、宮腔感染、子宮附件炎、盆腔炎（疑有厭氧菌感染時(shí)可合用甲硝唑）；皮膚軟組織感染：傳染性膿皰病、蜂窩組織炎、淋巴管（結）炎、皮下膿腫、肛周膿

健客價(jià)：￥16

補鈣藥。用于預防和治療鈣缺乏癥。

健客價(jià)：￥23

用于腸內異常發(fā)酵、消化不良、腸炎和小兒腹瀉。

健客價(jià)：￥4

本品適用于細菌性結膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、淚囊炎、術(shù)后感染等外眼感染。

健客價(jià)：￥8

適用于小兒佝僂病、軟骨病及發(fā)育不良。

健客價(jià)：￥40

用于治療缺鐵性貧血。

健客價(jià)：￥47.8

用于小面積、輕度外傷創(chuàng )面及感染創(chuàng )面的消毒。

健客價(jià)：￥8.5

本品用于治療缺鐵性貧血。

健客價(jià)：￥13.5

用于腸內異常發(fā)酵，消化不良、腸炎和小兒腹瀉。

健客價(jià)：￥10.9

本品適用于敏感細菌所引起的下列輕、中度感染：呼吸系統感染：急性支氣管炎、慢性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、彌漫性細支氣管炎、支氣管擴張合并感染、肺炎、咽喉炎、扁桃體炎（扁桃體周?chē)撃[）；泌尿系統感染：腎盂腎炎、復雜性尿路感染等；生殖系統感染：前列腺炎、附睪炎、宮腔感染、子宮附件炎、盆腔炎（疑有厭氧菌感染時(shí)可合用甲硝唑）；皮膚軟組織感染：傳染性膿皰病、蜂窩組織炎、淋巴管（結）炎、皮

健客價(jià)：￥13