循環(huán)生物標志物：多部分組成的復雜領(lǐng)域
循環(huán)生物標志物種類(lèi)紛繁，主要包括糖、膽固醇和蛋白質(zhì)生物標志物，例如C-反應蛋白（CRP）、循環(huán)的游離DNA（cfDNA）和循環(huán)RNA。此外，循環(huán)生物標志物還包括某些基因，如BCRA1、KRAS和其它基因。目前，該領(lǐng)域甚至囊括了循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）和外泌體/胞外囊泡（EVs）。
本文的主要內容
本文為我們系統地分析了循環(huán)生物標志物領(lǐng)域各方面的最新發(fā)展趨勢。循環(huán)生物標志物研究報告集中于一批分析類(lèi)/組。最近幾年，以下的一些類(lèi)別逐漸引起了人們的興趣和關(guān)注，特別是：
循環(huán)的游離核酸（循環(huán)的游離DNA和RNA）
循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）
胞外囊泡（外泌體，微囊泡）
我們將為大家呈現不同類(lèi)別循環(huán)生物標志物最新文獻的匯總和分析，以此來(lái)說(shuō)明該技術(shù)的使用、針對疾病的處理和每一個(gè)組成部分的發(fā)展軌跡。
圖1循環(huán)生物標志物不同類(lèi)別的文獻發(fā)表量
不同類(lèi)別循環(huán)標志物的文獻發(fā)表量
我們在PubMed網(wǎng)站上采用了多種關(guān)鍵詞的不同組合進(jìn)行了全面的檢索，并建立了如圖1所示的發(fā)表文獻數據庫。檢索記錄的多少反映了該研究方向的文獻發(fā)表量；這個(gè)數據庫包括的文獻發(fā)表在2000-2016年。每一個(gè)類(lèi)別循環(huán)標志物在PubMed上的文獻發(fā)表量的增長(cháng)率如圖2所示。
圖2標志物文獻發(fā)表增長(cháng)率
循環(huán)生物標志物研究領(lǐng)域的弱聯(lián)系
我們將生物標志物研究分為四個(gè)主要大類(lèi)：傳統循環(huán)生物標志物，循環(huán)DNA/RNA、循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）和胞外囊泡/外泌體。通過(guò)計算循環(huán)生物標志物四個(gè)類(lèi)別中共有的發(fā)表文獻，我們可以測定不同類(lèi)別中的交叉水平。表1的結果顯示，循環(huán)生物標志物領(lǐng)域不同類(lèi)別的發(fā)展更傾向于獨立，而非共同發(fā)展，這意味著(zhù)交叉協(xié)作或許可以更好地促使該領(lǐng)域發(fā)展。
數據庫的分割
為了更好地了解上述四類(lèi)生物標志物研究的關(guān)系，我們依據關(guān)鍵詞將發(fā)表文獻數據庫分為不同的部分。我們仔細閱讀了檢索獲得的25,604篇文獻所描述的病人特征、檢測方法、材料、基因和其它材料。我們在下面將向大家展示一些更為有趣的發(fā)現。
腫瘤是循環(huán)生物標志物領(lǐng)域的發(fā)展驅動(dòng)力
在循環(huán)生物標志物四個(gè)類(lèi)別的研究中，腫瘤幾乎占據了每一個(gè)類(lèi)別的最大份額。圖3、4和5分別說(shuō)明了腫瘤研究在循環(huán)標志物領(lǐng)域的增長(cháng)量，女性常見(jiàn)癌-
乳腺癌研究的增長(cháng)量，以及
癌癥發(fā)展的關(guān)鍵步驟-轉移研究的增長(cháng)量。
圖3腫瘤是三個(gè)類(lèi)別生物標志物的主要聚焦點(diǎn)。圖4乳腺癌是每一個(gè)類(lèi)別生物標志物的關(guān)注點(diǎn)。圖5轉移亦是每一個(gè)類(lèi)別標志物的焦點(diǎn)。
結果已經(jīng)顯而易見(jiàn)，不同類(lèi)別循環(huán)生物標志物的文獻發(fā)表均由腫瘤研究所驅動(dòng)。當然，亦如預期一致，腫瘤研究大大促進(jìn)了循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）的發(fā)展。在圖3中，我們依據不同的循環(huán)生物標志物類(lèi)別對乳腺癌的發(fā)表刊物進(jìn)行了劃分。
同樣的，我們看到了所有類(lèi)別的循環(huán)標志物研究均由乳腺癌所驅動(dòng)，特別是循環(huán)腫瘤細胞CTCs）。當然，這不足為奇，因為很大一部分的循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）的研究均采用了乳腺癌的腫瘤模型，加之循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）研究領(lǐng)域中乳腺癌相關(guān)文獻發(fā)表刊物量的變化與該趨勢是完全吻合的。
圖5的結果說(shuō)明循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是腫瘤轉移領(lǐng)域的主要研究方向，與之吻合的是CTCs被認為是驅動(dòng)腫瘤轉移的一個(gè)中介物。
外泌體和胞外囊泡
從研究視角來(lái)看，循環(huán)生物標志物的這部分目前是讓人們極為感興趣的方向，以及胞外囊泡或外泌體具有生物標志物運載體的潛能。我們希望了解該部分相較于其它循環(huán)生物標志物的發(fā)表刊物相對出增長(cháng)量。圖6展示了外泌體的文獻發(fā)表量。
正如我們所預期的，該數據顯示了與囊泡部分極為明顯的相關(guān)性，并提供了應用于該分析的方法、檢索和算法的良好內部控制。我們可以在圖7的胞外囊泡和圖8的微囊泡看到類(lèi)似的結果。
圖6相較于其它循環(huán)標志物類(lèi)別的外泌體相對發(fā)表量。圖7相較于其它循環(huán)標志物類(lèi)別的胞外囊泡（EVs）相對發(fā)表量。圖8相較于其它循環(huán)標志物類(lèi)別的微囊泡相對發(fā)表量。
新技術(shù)對于循環(huán)生物標志物類(lèi)別的影響
我們希望更進(jìn)一步了解不同的技術(shù)平臺，例如定量PCR（qPCR）、RNA測序（RNA-Seq）和二代測序（NGS），以及蛋白質(zhì)組學(xué)平臺，對于循環(huán)生物標志物發(fā)展的影響，這些技術(shù)平臺目前已被用來(lái)研究和揭示不同類(lèi)別循環(huán)生物標志物的標志物載體。
如圖9所示，循環(huán)游離核酸受到的影響最大，這亦讓我們深刻地了解到qPCR在這領(lǐng)域作為一個(gè)重要的技術(shù)平臺。
圖10說(shuō)明了RNA-Seq對于不同類(lèi)別循環(huán)標志物的影響。我們的數據顯示，除了循環(huán)腫瘤（CTCs）外，其它三類(lèi)循環(huán)生物標志物大大地滲透到了RNA-Seq領(lǐng)域。確實(shí)如此，大量的研究關(guān)注循環(huán)的游離核酸和表征囊泡里的RNA載體。應該注意的是外泌體和胞外囊泡研究中的標志物大多數是RNA載體。
圖9qPCR對不同種類(lèi)循環(huán)標志物研究的影響。圖10RNA-Seq作為研究循環(huán)標志物RNA載體的技術(shù)平臺。
此外，我們想問(wèn)的是循環(huán)生物標志物的那一部分涉及了蛋白質(zhì)組分（蛋白質(zhì)組學(xué)）的研究。圖11則向我們展現了這些數據。
正如數據所示，囊泡包括了參與蛋白質(zhì)組學(xué)分析的循環(huán)生物標志物。這非常重要，因為它說(shuō)明了胞外囊泡研究領(lǐng)域遠非核酸載體，亦開(kāi)始聚焦開(kāi)發(fā)這些循環(huán)標志物內的蛋白質(zhì)組分。我們將繼續監測該領(lǐng)域來(lái)評估研究發(fā)展趨勢。
圖11研究循環(huán)標志物蛋白組分的蛋白質(zhì)組學(xué)
最后，圖12呈現了NGS對于不同生物標志物的影響。這些數據清晰地說(shuō)明了循環(huán)核酸受到的影響是最大的。這是由于循環(huán)的游離核酸（如cfDNA）的復雜性造成的，因為它來(lái)源于基因組DNA。大多數的cfDNA來(lái)自于正常基因組序列，突變（腫瘤突變，驅動(dòng)突變等）需要從基因組的“汪洋大海”中捕獲。NGS則可以做到這樣，測序覆蓋深度將決定發(fā)現疾病相關(guān)稀有突變的窗口。
圖12NGS用于研究循環(huán)生物標志物
總結和結論
我們將循環(huán)生物標志物研究概括為四大類(lèi)，分別是傳統可溶性標志物、循環(huán)DNA/RNA、循環(huán)腫瘤細胞和循環(huán)囊泡（如外泌體、胞外囊泡和微囊泡）。循環(huán)生物標志物構成了略有重疊的四個(gè)研究領(lǐng)域。相互協(xié)作似乎在這些領(lǐng)域并不常見(jiàn)，因此有可能存在很大的機會(huì )去提高診斷測試開(kāi)發(fā)商和用戶(hù)對于該領(lǐng)域的接受度。
和很多生物學(xué)領(lǐng)域一樣，腫瘤是主要的驅動(dòng)因素。我們的結果說(shuō)明了大量的其它領(lǐng)域，例如自身免疫性疾病、神經(jīng)性疾病和感染性疾病，亦是重要的驅動(dòng)因素（數據未展示）。
如預期一致，qPCR是一個(gè)重要的工具。在該領(lǐng)域大量使用的還有熒光法、抗體法和分光光度法（數據未展示）。正如我們所預期的，NGS是該領(lǐng)域冉冉升起的新星。有趣的是，蛋白質(zhì)組學(xué)很大一部分限于外泌體領(lǐng)域，這提示我們研究團隊的興趣點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)外泌體/胞外囊泡的所有標志物載體。
我們相信這份比較循環(huán)生物標志物不同部分的行業(yè)分析是第一份全球性的分析報告，該分析報告將各個(gè)不同的新興領(lǐng)域匯總在一起進(jìn)行比較和對比。再者，從平行和整體角度來(lái)觀(guān)察這些領(lǐng)域的能力使得我們可視化它們的發(fā)展軌跡，以及不同技術(shù)平臺（如NGS）在一個(gè)或多個(gè)標志物類(lèi)別的應用。我們的數據庫相當全面和具體，因為我們的分析精細到單分子實(shí)體水平（基因、蛋白、microRNA等）。這個(gè)數據庫的價(jià)值在于它讓我們能夠查看這些分子對于不同循環(huán)生物標志物類(lèi)別的影響（數據未展示）。
最后，我們相信該分析是研究生命科學(xué)新興領(lǐng)域的一種正確方式；也就是說(shuō)，將一個(gè)領(lǐng)域分解為多個(gè)組成部分，并分析每一個(gè)部分以及與其它部分進(jìn)行比較分析，從而評價(jià)單獨和相互比較的定性和定量指標。
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