2010年1月至2014年12月上海兒童醫學(xué)中心PICU嬰兒膿毒癥病例130例，根據膿毒癥診斷標準分為膿毒癥組(51例)和嚴重膿毒癥組(79例)，同期健康
體檢兒童作為對照組(108例)。根據28d病死率將嚴重膿毒癥組分為生存組(45例)和死亡組(34例)兩個(gè)亞組。測定各組血清組蛋白濃度，并分析其與疾病嚴重程度及預后的相關(guān)性。培養人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)，用小牛胸腺組蛋白(calfthymushistone，CTH)以不同濃度(0、50、100、200及300μg/ml)及不同時(shí)間(200μg/mlCHT處理0、5、15、30、45、60min)處理后，用流式細胞儀檢測細胞存活率，以電鏡觀(guān)察細胞的形態(tài)學(xué)變化，以Westernblot檢測核因子(nuclearfactor，NF)-κB及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路中NF-κB抑制因子IκB以及磷酸化p38/p38表達，以ELISA檢測腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6表達水平。
結果
嚴重膿毒癥組患兒血清組蛋白水平(19.17&plu
smn;10.20)顯著(zhù)高于膿毒癥組(2.29±1.00)及對照組(0.23±0.26)(P<0.001)，并且在嚴重膿毒癥患兒中，死亡患兒血清組蛋白水平顯著(zhù)高于存活者(29.47±5.99vs.10.94±2.68，P<0.001)。體外實(shí)驗發(fā)現，隨CTH處理時(shí)間或者劑量增加，HUVEC的生存率逐步下降。掃描電鏡和透射電鏡觀(guān)察CTH處理后HUVEC發(fā)現細胞膜破壞現象。組蛋白可以激活NF-κB及MAPK通路，并釋放腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等炎性因子。
結論
在膿毒癥患者中胞外組蛋白濃度與疾病嚴重程度相關(guān)。CTH可以呈劑量依賴(lài)性及時(shí)間依賴(lài)性誘導HUVEC死亡。胞外組蛋白在膿毒癥中通過(guò)對
血管內皮細胞的毒性作用，介導疾病進(jìn)程，而這一毒性作用與破壞內皮細胞細胞膜及激活NF-κB及MAPK信號通路有關(guān)。
膿毒癥(sepsis)是當前重癥監護病房所面臨的棘手難題，病死率高達18%～29%[1]。膿毒癥病理過(guò)程復雜，涉及大量細胞因子、炎性介質(zhì)與凝血系統的激活，其中血管內皮細胞損傷導致的功能改變在其發(fā)病過(guò)程中起著(zhù)重要作用[2]。膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒性休克、多臟器功能不全綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)的發(fā)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，有效地遏制膿毒癥的發(fā)展進(jìn)程，對降低膿毒性休克及MODS的發(fā)生率和病死率十分重要。
到目前為止，尚沒(méi)有一項可單獨用于膿毒癥患者疾病進(jìn)展和預后的評估指標。2009年，Xu等[3]首次報道細胞外組蛋白在膿毒癥小鼠血清中的含量顯著(zhù)高于正常小鼠，利用抗體中和組蛋白可以明顯抑制膿毒癥小鼠的死亡，說(shuō)明細胞外組蛋白是膿毒癥的主要致死性因素。目前仍少有研究關(guān)注膿毒癥患者疾病嚴重程度和胞外組蛋白濃度之間的關(guān)系。因此，本研究將探討膿毒癥患兒胞外組蛋白水平與膿毒癥嚴重程度之間的關(guān)系，并探究組蛋白對內皮細胞毒性損傷的作用機制。
1對象與方法
1.1研究對象及分組
2010年1月至2014年12月收集上海兒童醫學(xué)中心PICU嬰兒膿毒癥病例130例，其中男72例(55.4%)，女58例(44.6%)。發(fā)病年齡為1～12個(gè)月，平均年齡4.4個(gè)月。根據膿毒癥診斷標準分為膿毒癥組(51例)和嚴重膿毒癥組(79例)，同期兒保科健康體檢嬰兒作為對照組(108例)，其中男64例，女44例，年齡1～12個(gè)月，平均年齡6.3個(gè)月。根據28d病死率將嚴重膿毒癥組分為生存組(45例)和死亡組(34例)兩個(gè)亞組。膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒性休克、MODS的診斷參照2005年美國胸科醫師學(xué)會(huì )/危重病醫學(xué)會(huì )發(fā)布的擬訂標準[4，5]；排除標準：(1)基礎疾病預后惡劣，并可能成為患者死亡的主要原因；(2)
惡性腫瘤終末期；(3)自身免疫性疾病。該臨床研究通過(guò)上海交通大學(xué)醫學(xué)院附屬上海兒童醫學(xué)中心的倫理批準并簽署了知情同意書(shū)。
1.2主要試劑與細胞
人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)購于美國ATCC公司；組蛋白檢測CellDeathDetectionKit購于美國Roche公司；FITC-抗AnnexinV/PI購于美國B(niǎo)D公司；核因子(nuclearfactor，NF)-κBP65、NF-κBP50、NF-κB抑制因子(IκB)Ba抗體購于CST公司；腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)-α，白細胞介素(interleukin，IL)-6試劑盒購于美國B(niǎo)io-Rad公司。
1.3方法
1.3.1臨床樣本采集及血清組蛋白檢測
患兒入院或被診斷為膿毒癥后即刻采集外周血1ml，以1500轉/min轉速分離8min后吸取上清，保存于－80℃，用于ELISA檢測前置于室溫解凍。胞外組蛋白的檢測按ELISA檢測試劑盒方法[6]，在包備有抗DNA抗體的96孔板加入20μl患兒血漿，在室溫下孵育2h，再加入生物素標記的抗組蛋白抗體，在室溫下孵育20min，再利用分光光度計檢測405nm和490nm的吸光度值。
1.3.2細胞培養處理及流式細胞儀檢測
取對數生長(cháng)期HUVEC，按5×105個(gè)細胞接種到6孔板，第2天經(jīng)不同濃度和不同處理時(shí)間的小牛胸腺組蛋白(calfthymushistone，CTH)處理后收集細胞，離心，經(jīng)過(guò)處理及AnnexinV/PI染色后，流式細胞儀檢測細胞存活率，AnnexinV/PI雙染色陰性細胞為存活細胞。不同濃度的CTH：0、50、100、200及300μg/ml，在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育1h；不同處理時(shí)間的CTH：200μg/ml處理0、5、15、30、45、60min。
1.3.3電鏡標本制備
經(jīng)50或200μg/mlCTH孵育HUVEC1h后，用體積分數為4%的戊二醛固定，再經(jīng)脫水、包埋、切片、醋酸鈾-硝酸鉛雙重染色制成超薄切片，在電鏡下觀(guān)察組蛋白對血管內皮細胞的損傷。
1.3.4Westernblot檢測NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路中NF-κB抑制因子IκB以及磷酸化p38/p38表達
組蛋白孵育HUVEC后，裂解細胞，經(jīng)Westernblot檢測IκB的蛋白水平以及P38蛋白的磷酸化水平。選取不同孵育濃度(0、50、100及200μg/ml)和200μg/ml下不同處理時(shí)間(0、15、30、45、60min)以檢測IκB的蛋白水平以及P38蛋白的磷酸化水平是否與組蛋白的處理時(shí)間和劑量相關(guān)。
1.3.5TNF-α和IL-6的檢測
按ELISA檢測試劑盒方法，除空白孔外，加入標本或不同濃度標準品各100μl至相應孔中，37℃孵育60min；洗板后依次加入生物素抗體、酶結合物100μl/孔，37℃各孵育60min、30min；加顯色劑，避光孵育10～25min；終止液終止，即刻測量OD450值，并根據標準曲線(xiàn)查出其濃度。
1.4統計學(xué)方法
所有數據均應用SPSS19.0統計分析軟件進(jìn)行統計學(xué)處理。計量資料以均數±標準差(±s)表示，各指標變化的組間比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析，P<0.05為差異有統計學(xué)意義。
2結果
2.1胞外組蛋白水平與膿毒癥的嚴重程度相關(guān)
嚴重膿毒癥組患兒血清組蛋白水平(19.17±10.20)顯著(zhù)高于膿毒癥組(2.29±1.00)及對照組(0.23±0.26)(P<0.001)，見(jiàn)圖1。在嚴重膿毒癥患兒中，死亡患兒血清組蛋白水平顯著(zhù)高于存活患兒(29.47±5.99vs.10.94±2.68，P<0.001)，見(jiàn)圖2。
2.2CTH可直接引起血管內皮細胞死亡，并呈現劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性
CTH與內皮細胞共同孵育，用50μg/ml的CTH處理1h就可以使HUVEC的存活率明顯下降，隨著(zhù)CTH濃度增加，可導致內皮細胞死亡增加，且呈劑量依賴(lài)性(圖3)。200μg/mlCTH處理HUVEC15min就可以使HUVEC的存活率明顯下降，隨著(zhù)共同孵育時(shí)間增加，可導致內皮細胞死亡增加，呈時(shí)間依賴(lài)性(圖4)。
2.3CTH對血管內皮細胞損傷電鏡觀(guān)察結果
掃描電鏡和透射電鏡都可以觀(guān)察到，50μg/ml的CTH即可輕微損傷細胞膜，200μg/mlCTH孵育HUVEC后，其細胞膜嚴重破損(圖5A3中的黑洞，圖5B3中放大的細胞膜部分)；細胞核中的染色質(zhì)出現凝集(圖5B3)。
2.4CTH激活NF-κB和MAPK信號通路
如圖6、圖7所示，CTH處理會(huì )導致IκB蛋白的降解以及p38磷酸化水平的增加，NF-κB和MAPK通路被激活。并且，IκB蛋白的降解以及p38磷酸化水平的增加呈現CTH處理時(shí)間和劑量的依賴(lài)性。隨著(zhù)CTH孵育濃度的增加或處理時(shí)間的延長(cháng)，IκB的蛋白水平逐漸降低，p38磷酸化水平逐漸升高，提示NF-κB和MAPK通路的激活程度增加。但當CTH濃度為50μg/ml時(shí)，IκB的蛋白水平并未受到影響，提示此濃度還不足以激活NF-κB信號通路。
2.5CTH促進(jìn)HUVEC釋放TNF-α和IL-6
經(jīng)不同濃度的CTH孵育HUVEC后，通過(guò)ELISA檢測細胞上清中的TNF-α和IL-6水平，結果顯示CTH可促進(jìn)TNF-α和IL-6的釋放(圖8、圖9)。并且，TNF-α和IL-6的釋放呈現劑量依賴(lài)性。在50μg/mlCTH處理時(shí)，TNF-α的濃度為(137.15±28.16)pg/ml，IL-6為(3.89±0.87)pg/ml；而200μg/mlCTH處理時(shí)，TNF-α的濃度為(312.36±32.57)pg/ml，IL-6為(5.81±0.76)pg/ml。
3討論
組蛋白是一種帶有強正電荷的核蛋白，正常的生理功能是在核內與DNA相結合形成核小體，并發(fā)揮調控基因表達的作用。但是當組蛋白被主動(dòng)或被動(dòng)地釋放到細胞外空間后可以在多個(gè)系統或器官中發(fā)揮促炎作用和直接的毒性作用[7，8，9，10]。盡管Xu等[3]的研究表明，胞外組蛋白在膿毒癥小鼠中是致死的關(guān)鍵因素，但是目前尚沒(méi)有相關(guān)的臨床研究證明胞外組蛋白與膿毒癥疾病嚴重程度及預后的關(guān)系。在本研究中，我們發(fā)現膿毒癥患兒的胞外組蛋白較健康兒童有明顯增高，而且其水平與疾病嚴重程度相關(guān)。因此，升高的胞外組蛋白水平有可能被用作一種提示膿毒癥疾病進(jìn)展程度和疾病預后的臨床生物指標。膿毒癥的病理生理過(guò)程相當復雜，涉及多種細胞的激活、炎癥因子的釋放和凝血系統的啟動(dòng)。膿毒癥疾病進(jìn)展的一個(gè)重要受累組織是血管內皮。血管內皮的完整對于維持血流動(dòng)力學(xué)正常，防止凝血途徑異常激活和適度的免疫反應有著(zhù)重要作用，而以上三項正是膿毒癥發(fā)展的重要條件[11]，而內皮細胞的活化和功能障礙是膿毒癥發(fā)展惡化的中心環(huán)節[12，13]。中性粒細胞激活后形成的胞外誘捕網(wǎng)(neutrophilextracellulartraps)和組蛋白已經(jīng)在體外實(shí)驗中多次被證實(shí)對上皮細胞和內皮細胞有毒性作用[3，14，15]，但其相關(guān)機制尚不明。本研究的結果顯示，組蛋白可以破壞內皮細胞細胞膜，導致或部分導致細胞死亡，造成內皮細胞功能障礙。而全身內皮細胞活化可以導致微血管病變，微血管通透性增高，白細胞黏附和遷移，活性氧家族的活化，血管擴張和細胞因子的產(chǎn)生致使組織乏氧，最終導致器官功能障礙甚至死亡[16]。
此外，本研究顯示組蛋白可以激活HUVEC中的NF-κB及MAPK信號通路，而NF-κB作為參與基因表達和調控的一種重要的誘導性核轉錄因子，其激活可導致TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)的大量表達和釋放，這些炎癥介質(zhì)的表達和釋放又會(huì )進(jìn)一步加強炎癥信號通路的激活，促使正反饋環(huán)的形成，最終導致過(guò)度炎癥反應。而組蛋白損傷內皮細胞后，又進(jìn)一步促使其釋放組蛋白，從而再促進(jìn)中性粒細胞釋放胞外誘捕網(wǎng)和加重內皮細胞的損傷，引起“細胞因子瀑布”，進(jìn)一步加重膿毒癥的快速進(jìn)展，并引發(fā)多臟器的損傷。
本研究統計顯示嬰兒膿毒癥或嚴重膿毒癥患者，往往起病急，進(jìn)展快，多在收入PICU48h內給予積極搶救治療后仍無(wú)好轉死亡。此類(lèi)患兒如何早期識別和干預，對改善預后至關(guān)重要。我們在體外研究中發(fā)現，組蛋白對內皮細胞毒性作用與劑量及作用時(shí)間有關(guān)；同時(shí)在臨床研究中發(fā)現，組蛋白水平與膿毒癥患者的疾病嚴重程度和預后相關(guān)。因此血清組蛋白在一定程度上可以表明疾病的嚴重程度，早期和連續檢測可以判別治療的效果。這種變化在生存組與死亡組中的差異亦非常顯著(zhù)。胞外組蛋白在嚴重膿毒癥早期即有明顯升高，故可作為嚴重膿毒癥的早期識別指標。
組蛋白作為一種損傷相關(guān)的模式分子可以用于提示組織和臟器的損傷[17]，組蛋白通過(guò)破壞內皮細胞細胞膜和激活NF-κB及MAPK通路放大其組織損傷的程度，這也是組蛋白可能成為治療和控制炎癥反應的治療靶點(diǎn)的理論依據。膿毒癥患兒胞外組蛋白絕對水平與其病死率相關(guān)。因此，危重癥患者合并膿毒癥時(shí)檢測血清組蛋白有助于早期診斷、監測病情發(fā)展及判斷預后。及時(shí)篩選出重癥患兒，進(jìn)行干預，阻斷其引發(fā)的瀑布效應，阻止膿毒癥的進(jìn)程，降低病死率。
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