過去二十年間，隨著對(duì)肺癌相關(guān)研究的深入，化療、靶向治療、免疫治療等治療手段不斷推陳出新，肺癌治療水平得到了長足進(jìn)步。而肺癌患者的精準(zhǔn)治療離不開分子生物學(xué)及診斷科技的發(fā)展，液態(tài)活檢作為新興的檢測技術(shù)在肺癌臨床中的應(yīng)用日趨成熟。

日前，在深圳舉辦的“第六屆羅氏診斷全國腫瘤高峰論壇”上，沈陽市肺癌診治中心、沈陽市胸科醫(yī)院腫瘤內(nèi)科主任李茵茵就液態(tài)活檢在肺癌中的臨床應(yīng)用進(jìn)行了分享，她指出：“液態(tài)活檢已成為組織活檢的有力補(bǔ)充。在部分應(yīng)用場景中，液態(tài)活檢相比組織活檢具有更大的優(yōu)勢，有助于進(jìn)一步提高肺癌的精準(zhǔn)診斷和個(gè)體化治療水平。”

從組織活檢到液態(tài)活檢，肺癌精準(zhǔn)診斷進(jìn)階

組織活檢作為腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在臨床實(shí)踐中仍存一定的局限性，包括組織活檢的滯后性、部分患者因自身?xiàng)l件不適合組織活檢、有創(chuàng)的組織活檢可能加速腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、已發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥患者組織取樣可能無法反映患者整體情況等[1]。此外，就肺癌而言，肺癌同一瘤體的不同位置、腫瘤細(xì)胞的分化與基因型均存在差異，是一種高度異質(zhì)性的腫瘤[2]。當(dāng)發(fā)生疾病進(jìn)展、藥物耐藥或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞的亞克隆不斷變化，異質(zhì)性情況更加多元，組織活檢因而難以完全覆蓋臨床的需求[3,4]。

液態(tài)活檢通過取樣腦脊液、唾液、胸水、血液、腹水、尿液等對(duì)疾病進(jìn)行診斷，能在一定程度上避免組織異質(zhì)性對(duì)腫瘤分子分型的影響?；谘旱囊簯B(tài)活檢是目前最主要的研究方向，主要檢測血液中游離的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和外泌體（Exosome）。

ctDNA由腫瘤細(xì)胞釋放到血液中，往往帶有腫瘤組織的基因突變信息，能夠檢測到包含點(diǎn)突變（SNV）、短片段插入缺失（Indel）、融合基因（Fusion）、拷貝數(shù)變異（CNV）等各類基因突變，可有效覆蓋臨床用藥所需位點(diǎn)的檢測。CTC通常包含更多的信息，如更完整的轉(zhuǎn)錄組、蛋白表達(dá)等，但相較于已較為成熟的ctDNA提取和檢測，將CTC從大量血細(xì)胞中富集出來并加以檢測的流程更加復(fù)雜。若能獲得存活的CTC，對(duì)后續(xù)個(gè)體化醫(yī)療動(dòng)物模型構(gòu)建將有較大幫助[5]。

相較于組織活檢，液態(tài)活檢技術(shù)具有三大明顯優(yōu)勢：一是血檢樣本可及性更高，可以提升很多晚期和復(fù)發(fā)患者的樣本可及性，規(guī)避組織活檢存在的潛在臨床風(fēng)險(xiǎn)；二是能夠避免組織樣本異質(zhì)性與取材的風(fēng)險(xiǎn)，同一腫瘤的不同位置、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的分子分型都可能存在差異，而組織活檢可能無法對(duì)整個(gè)腫瘤區(qū)域進(jìn)行全覆蓋；三是可多次取樣，更易于實(shí)現(xiàn)術(shù)后微小殘留病灶（MRD）以及治療效果的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。

分子診斷指導(dǎo)肺癌全程管理，助推精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展

肺癌液態(tài)活檢技術(shù)主要包括數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（dPCR）、實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）和二代測序（NGS）三種。其中，dPCR通常用于單位點(diǎn)檢測；qPCR用于單基因多位點(diǎn)檢測；NGS則可同時(shí)檢測大量基因的不同突變類型。

qPCR是目前最為成熟的液態(tài)活檢技術(shù)，當(dāng)前主要應(yīng)用于檢測ctDNA中的表皮生長因子受體（EGFR）突變。以新一代cobasEGFR突變檢測（cobasEGFRMutationTestv2）為例，其采用等位基因特異擴(kuò)增（ASA），利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR擴(kuò)增引物，只有在引物3’堿基與模板配對(duì)時(shí)才能出現(xiàn)PCR擴(kuò)增帶，使ASA引物在野生型DNA上不擴(kuò)增，減少假陽性率。

一項(xiàng)多中心、開放標(biāo)簽、隨機(jī)化III期研究試驗(yàn)ENSURE，用于評(píng)估厄洛替尼與吉西他濱/順鉑作為EGFR19Del/L858RIIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者一線治療方案的療效和安全性，研究中的晚期NSCLC患者經(jīng)cobasEGFRMutationTestv2血漿檢出EGFR激活突變，一線使用厄洛替尼治療后，無進(jìn)展生存期（PFS）比化療有顯著提升[6]。另一項(xiàng)II期、多中心研究AURA2試驗(yàn)的匯總分析中，晚期NSCLC患者通過cobasEGFRMutationTestv2檢測到血漿T790M陽性，其可以從三代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）藥物奧希替尼治療中獲益[7]。

cobasEGFRMutationTestv2可識(shí)別18-21號(hào)外顯子區(qū)域42種基因突變，包括L858R、19號(hào)外顯子缺失、L861Q等TKI敏感性突變和包括T790M在內(nèi)的TKI耐藥性突變，是市場上覆蓋點(diǎn)位最多的EGFR檢測，有助于臨床鑒別出更多能從靶向治療獲益的患者。

此外，NGS技術(shù)可獲得ctDNA中各個(gè)基因的突變信息，有助于進(jìn)一步避免腫瘤異質(zhì)性問題，全面分析腫瘤突變情況，同時(shí)在用藥監(jiān)測、MRD監(jiān)測、血液腫瘤突變負(fù)荷（bTMB）監(jiān)測等方面為臨床提供更多的決策依據(jù)[8]。然而，NGS在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題：如從每份血樣中提取獲得的游離DNA（cfDNA）都相對(duì)較少，樣本量有限；cfDNA中僅有極小的部分是ctDNA，存在背景噪音；不同研究對(duì)象之間的腫瘤特異性突變也有所不同；同時(shí)NGS文庫制備流程復(fù)雜，各個(gè)環(huán)節(jié)的PCR都可能引入潛在的擴(kuò)增錯(cuò)誤，從而影響檢測準(zhǔn)確性[9]。

羅氏診斷CAPP-Seq深度測序技術(shù)通過在文庫構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)的優(yōu)化，引入單分子標(biāo)簽方案，有效提升了NGS技術(shù)用于檢測ctDNA中EGFR突變的特異性與敏感性。

基于AVENIOSurveillance197panel動(dòng)態(tài)監(jiān)測肺癌MRD的臨床試驗(yàn)共入組40例IbIII期局限性肺癌患者，在治療結(jié)束后4個(gè)月內(nèi)首次（MRD界標(biāo)點(diǎn)）進(jìn)行血漿ctDNA分析，之后每3-6個(gè)月動(dòng)態(tài)監(jiān)測ctDNA水平，結(jié)果表明，ctDNA陽性檢測可早于72%的影像學(xué)診斷的腫瘤復(fù)發(fā)，中位時(shí)間提前5.2個(gè)月。無論在MRD界標(biāo)點(diǎn)，還是全隨訪病程，ctDNA陽性患者在PFS及疾病特異生存期均顯著低于ctDNA陰性患者[10]。

在免疫治療領(lǐng)域，POPLAR和OAK研究回顧性分析均顯示，當(dāng)bTMB≥16時(shí)，采用Atezolizumab治療的NSCLC患者臨床獲益顯著優(yōu)于化療，提示bTMB可作為一個(gè)獨(dú)立預(yù)測生物標(biāo)志物。

“基于qPCR的液態(tài)活檢技術(shù)最為成熟，經(jīng)過充分論證，已大規(guī)模應(yīng)用于臨床。dPCR的超高靈敏度在血檢中有一定優(yōu)勢，但一次檢測位點(diǎn)較少可能限制其后續(xù)的應(yīng)用場景。而基于NGS的液態(tài)活檢通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測等應(yīng)用場景，有助于患者的全流程管理，后續(xù)有較大潛力，但由于其技術(shù)的復(fù)雜性，其應(yīng)用仍需進(jìn)一步論證與優(yōu)化。”李茵茵主任總結(jié)道，“未來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展革新，液態(tài)活檢的檢測靈敏度和特異性將不斷提高，液態(tài)活檢必將成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療中的重要一環(huán)。”