厭氧菌的分離與鑒定概述

厭氧菌的分離與鑒定是對氧敏感度高的細菌進(jìn)行分離與鑒別的試驗，因為厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類(lèi)繁多，其生理作用日益受到人們的重視。專(zhuān)性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養及活菌計數的關(guān)鍵是提供無(wú)氧和低氧化還原電勢的培養環(huán)境。 

• 檢查部位 其他
• 科室 內科體檢、保健科
• 相關(guān)疾病
• 相關(guān)癥狀 糖尿病皮膚病變

厭氧菌的分離與鑒定正常值

• 體內菌群的種類(lèi)和比例正常，人體處于動(dòng)態(tài)平衡健康狀態(tài)。 

厭氧菌的分離與鑒定臨床意義

• 下面主要介紹的是一種簡(jiǎn)便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術(shù)，亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術(shù)。
  異常結果：由厭氧梭狀芽胞桿菌所致的特殊病癥如氣性壞疽、破傷風(fēng)、肉毒中毒等。
  需要檢查的人群：有糖尿病，嚴重肝病，肝硬化，尿毒癥，褥瘡潰瘍，肢體壞疽，肉毒中毒等癥狀的患者。 

厭氧菌的分離與鑒定檢查方法

• 分離
  (1)編號
  取五支無(wú)菌水試管，分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。
  (2)稀釋
  在無(wú)氧無(wú)菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無(wú)菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無(wú)菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)?0-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管計數。
  (3)滾管分離
  1)滾管
  將無(wú)氧無(wú)菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時(shí)，要用N2在培養基內中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內空氣，然后把培養基加入管內，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內，及時(shí)拔出充氣針頭。用無(wú)菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤(pán)中迅速滾動(dòng)，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會(huì )即刻形成凝固層。
  2)分離純化
  生成的菌落需挑取出來(lái)，鏡檢其形態(tài)及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀(guān)察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開(kāi)試管膠塞，同時(shí)迅速將氣流適當、火焰滅過(guò)菌的氮氣長(cháng)針頭插入管內。同時(shí)，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過(guò)菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養，培養24h或更長(cháng)時(shí)間或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。
  3)劃線(xiàn)分離
  將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著(zhù)打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線(xiàn)后的卷管直立保溫，使用CO2：H2=80：20，因為CO2比空氣重，開(kāi)啟后管塞不致有空氣殘留。劃線(xiàn)后的滾管，置34-37度下培養，便可長(cháng)出菌落。
  菌種的鑒定
  1.糖發(fā)酵試驗
  糖發(fā)酵實(shí)驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類(lèi)作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產(chǎn)酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可以利用指示劑來(lái)斷定。在配制培養基時(shí)預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)]，當發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。
  具體實(shí)驗步驟：
  ① 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)笤跓o(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。
  ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
  ③ 24h后觀(guān)察各管中液體顏色變化及產(chǎn)氣情況。
  2.蛋白質(zhì)分解實(shí)驗
  ① 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)笤跓o(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。
  ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
  ③24h后各管分別進(jìn)行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。
  3.淀粉水解實(shí)驗
  ① 將菌液進(jìn)行適當稀釋?zhuān)笤跓o(wú)菌環(huán)境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無(wú)菌封口膜封口。
  ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
  ③ 24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀(guān)察淀粉的水解情況。 

厭氧菌的分離與鑒定注意事項

• 在進(jìn)行厭氧菌分離鑒定的過(guò)程中，需注意下述事項。
  (1)厭氧標本在采集和運輸的過(guò)程中必須與空氣隔絕，務(wù)必在30min內完成，同時(shí)應避免正常菌群的污染。
  (2)培養基要新鮮配制，若儲存太久，有氧氣溶解在表面或有過(guò)氧化物在培養基中，不利于厭氧菌生長(cháng)。
  (3)若菌落太小，需用放大鏡觀(guān)察菌落。
  (4)做耐氧試驗，要求從每個(gè)瓊脂平板上挑取4～5個(gè)性狀不同的菌落，分別接種需氧和厭氧血瓊脂平板，置于需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養。
  (5)如做胞外酶鑒定，一定要有足夠的菌液濃度。