流式細胞DNA分析概述

流式細胞DNA分析是可以研究間期細胞，并不受細胞增殖狀態(tài)的影響，對檢測胸腔積液中的惡性細胞的有重要意義的一種檢查方法。　
流式細胞儀的檢測范圍：
1.流式細胞儀可以檢測細胞結構，包括：細胞大小、細胞粒度、細胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細胞周期、RNA 含量、蛋白質(zhì)含量。
2.流式細胞儀可以檢測細胞功能，包括：細胞表面/ 胞漿/ 核的特異性抗原、細胞活性、細胞內細胞因子、酶活性、激素結合位點(diǎn)和細胞受體。 

• 檢查部位 其他
• 科室 內科體檢、保健科
• 相關(guān)疾病 反應性漿細胞增多癥 小兒苯丙酮尿癥 結核性胸膜炎
• 相關(guān)癥狀 滲出性胸水 血性胸水 胸水 惡性胸水 肺癌胸水

流式細胞DNA分析正常值

• 身體處于動(dòng)態(tài)平衡中，沒(méi)有疾病。 

流式細胞DNA分析臨床意義

• 流式細胞儀的臨床應用：
  (1) 流式細胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應用：流式細胞術(shù)可以檢測腫瘤細胞增殖周期、檢測腫瘤細胞表面標記、癌基因表達產(chǎn)物、進(jìn)行多藥耐藥性分析、檢測凋亡
  (2) 流式細胞術(shù)在血液學(xué)中的應用：檢測白血病和淋巴瘤細胞、活化血小板、造血干細胞(CD34+)計數、白血病與淋巴瘤的免疫分型、網(wǎng)織紅細胞計數、細胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監測
  (3) 流式細胞術(shù)在免疫學(xué)中的應用：可以進(jìn)行淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞免疫分型、檢測細胞因子。異常結果：有資料表示對71例胸腔積液做流式細胞DNA分析，結果顯示，對惡性胸腔積液診斷的敏感性為52%，特異性達100%。若與常規檢查聯(lián)合應用，則可使診斷的敏感性達到94%。癌性胸水細胞的DNA分析可見(jiàn)異倍體和S期、G2/M期細胞比例增高。
  需要檢查的人群：疑似有癌性胸水等相關(guān)疾病者 。

流式細胞DNA分析檢查方法

• 1.備齊用物，標本容器上貼好標簽，核對無(wú)誤后向患者解釋以取得合作。露出患者手臂，選擇靜脈，于靜脈穿刺部位上方約4～6cm處扎緊止血帶，并囑患者握緊拳頭，使靜脈充盈顯露。
  2.常規消毒皮膚，待干。
  3.在穿刺部位下方，以左手拇指拉緊皮膚并固定靜脈，右手持注射器，針頭斜面向上與皮膚成15度～30度，在靜脈上或旁側刺入皮下，再沿靜脈走向潛行刺入靜脈，見(jiàn)回血后將針頭略放平，稍前行固定不動(dòng)，抽血至需要量時(shí)，放松止血帶，囑患者松拳，干棉簽按壓穿刺點(diǎn)，迅速拔出針頭，并將患者前臂屈曲壓迫片刻。
  4.卸下針頭，將血液沿管壁緩緩注入容器內，切勿將泡沫注入，以免溶血。容器內放有玻璃珠時(shí)應迅速搖動(dòng)，以除去纖維蛋白原;如系抗凝試管，應在雙手內旋轉搓動(dòng)，以防凝固;如系干燥試管，不應搖動(dòng);如系液體培養基，應使血液與培養液混勻，并在血液注入培養瓶前后，用火焰消毒瓶口，注意勿使瓶塞接觸血液。
  5.送實(shí)驗室檢查。 

流式細胞DNA分析注意事項

• 流式細胞儀并非是完全自動(dòng)化的儀器，準確的實(shí)驗結果還需要準確的人工技術(shù)配合，所以標本制備需要規范，儀器本身亦需要質(zhì)量控制。
  (一) 流式細胞術(shù)免疫學(xué)檢測的影響因素和質(zhì)量控制
  流式細胞術(shù)在免疫學(xué)中有著(zhù)廣泛的應用，其免疫熒光染色的標本制備非常重要，常常由于標本制備過(guò)程中出現人為非特異性熒光干擾(尤其在間接免疫熒光染色中)或細胞濃度低等影響檢測結果。解決這些影響因素的方法如下：
  (1) 確保標本上機檢測前的濃度為1X106細胞/ml，細胞濃度過(guò)低直接影響檢測結果。
  (2) 使用蛋白封閉劑，封閉非特異結合位點(diǎn)，尤其在間接免疫熒光標記時(shí)必不可少。常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。
  (3) 熒光抗體染色后充分洗滌，注意混勻和離心速度，減少重疊細胞和細胞碎片。
  (4) 設置對照樣品，采用與抗體來(lái)源同型匹配的無(wú)關(guān)對照和熒光抗體的本底對照。
  (5) 判定結果時(shí)，應注意減去本底熒光，為使免疫熒光的定量分析更精確，應用計算機程序軟件，用擬合曲線(xiàn)方法從實(shí)驗組的曲線(xiàn)峰值中減去對照組的曲線(xiàn)峰值，可以得到更準確的免疫熒光定量結果。
  (6) 注意染色后避光，保證細胞免疫熒光的穩定。
  (二) DNA 倍體分析的質(zhì)量控制仍沒(méi)有統一的標準，各文獻報道的實(shí)驗結果差異較大，1993年10月美國癌癥研究組織制定了FCMDNA 測定的統一標準，我們根據這些標準并結合國內有經(jīng)驗的專(zhuān)家多年的實(shí)踐，對FCM的DNA分析技術(shù)的質(zhì)控和注意事項進(jìn)行說(shuō)明。
  (1) 手術(shù)切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時(shí)，要避免出血壞死組織。
  (2) 標本采集后要及時(shí)固定或深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA 降解，而造成測試結果的誤差。
  (3) 固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度，70%的乙醇固定效果較好。
  (4) 單細胞懸液制備過(guò)程中，注意將待測細胞成分分離出來(lái)，減少其他成分的干擾，并注意不要損傷該群細胞。
  (5) 細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度，即1X106細胞/ml，雜質(zhì)、碎片、團塊和重疊細胞應<2%，對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品，至少有20%的腫瘤細胞存在。
  (6) 石蠟包埋組織單細胞制備時(shí)要注意：取材時(shí)應選取無(wú)自溶、壞死的組織，對腫瘤組織標本，選取含腫瘤細胞豐富的區域;石蠟組織片的厚度要適宜，最好為40～50μm 。過(guò)薄或過(guò)厚的切片均會(huì )影響檢測結果;徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性，驗證脫蠟是否完全的方法是棄去二甲苯，加入100%乙醇，如果無(wú)絮狀物浮起，說(shuō)明蠟已脫凈;水化要充分，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態(tài);注意消化的時(shí)間和消化酶的活性。常規使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。
  (三) 操作方面
  (1) 流式細胞儀在整個(gè)工作過(guò)程中處于最佳狀態(tài)，能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異系數在最小范圍，分辨率在最好狀態(tài)，能避免在測量過(guò)程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。
  (2) 評價(jià)儀器精度的重要指標是儀器的變異系數(CV)，對于校準樣品，其CV值越小越好，CV值越小，說(shuō)明儀器校正的精度越高。校準樣品包括非生物樣品(熒光微球)和生物細胞樣品(人淋巴細胞、雞紅細胞等) 。目前，非生物熒光微球已有商品試劑，CV一般<2%～3%。
  (四) 資料分析方面
  (1) 當樣品中碎片雜質(zhì)或團塊過(guò)多，所測細胞數在20%以下，組方圖的基線(xiàn)抬高時(shí)，應放棄分析處理。
  (2) 做細胞周期分析時(shí)，樣品細胞數應在1萬(wàn)個(gè)，排除碎片、雜質(zhì)和團塊，當異倍體細胞數占總細胞數10%以下時(shí)，需要結合其他診斷指標，不可盲目下結論，至少異倍體細胞占總細胞數的20%以上，可以確定異倍體的存在。
  (3) DNA分析時(shí)，正常二倍體細胞組方圖CV值>8%時(shí)放棄分析，但腫瘤細胞的CV值>8%，與腫瘤細胞的異質(zhì)性有關(guān)。另外，DNA倍體分析時(shí)，同源組織的不同個(gè)體會(huì )出現10 %的漂移。
  (4 )DNA倍體標準的質(zhì)量控制，采用相同個(gè)體同源正常組織、同樣固定方法、相同的樣品處理方法、相同的染色方法、同步染色、同樣的儀器檢測條件、正常的二倍體組織作為內標準。